Biokimia Asam Nukleat

Tugas Mandiri Biokimia Asam Nukleat Abu Zar 108 101 000 006 Kes Mas 2A Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Program Studi Kesehatan Masyarakat UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 2009 Asam Nukleat 1. Struktur Molekul Asam nukleat merupakan salah satu makromolekul yang memegang peranan sangat penting dalam kehidupan organisme karena di dalamnya tersimpan informasi genetik. Asam nukleat sering dinamakan juga polinukleotida karena tersusun dari sejumlah molekul nukleotida sebagai monomernya. Tiap nukleotida mempunyai struktur yang terdiri atas gugus fosfat, gula pentosa, dan basa nitrogen atau basa nukleotida (basa N). Ada dua macam asam nukleat, yaitu asam deoksiribonukleat atau deoxyribonucleic acid (DNA) dan asam ribonukleat atau ribonucleic acid (RNA). Dilihat dari strukturnya, perbedaan di antara kedua macam asam nukleat ini terutama terletak pada komponen gula pentosanya. Pada RNA gula pentosanya adalah ribosa, sedangkan pada DNA gula pentosanya mengalami kehilangan satu atom O pada posisi C nomor 2’ sehingga dinamakan gula 2’-deoksiribosa (Gambar 2.1.b). Perbedaan struktur lainnya antara DNA dan RNA adalah pada basa N-nya. Basa N, baik pada DNA maupun pada RNA, mempunyai struktur berupa cincin aromatik heterosiklik (mengandung C dan N) dan dapat dikelompokkan menjadi dua golongan, yaitu purin dan pirimidin. Basa purin mempunyai dua buah cincin (bisiklik), sedangkan basa pirimidin hanya mempunyai satu cincin (monosiklik). Pada DNA, dan juga RNA, purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G). Akan tetapi, untuk pirimidin ada perbedaan antara DNA dan RNA. Kalau pada DNA basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin (T), pada RNA tidak ada timin dan sebagai gantinya terdapat urasil (U). Timin berbeda dengan urasil hanya karena adanya gugus metil pada posisi nomor 5 sehingga timin dapat juga dikatakan sebagai 5-metilurasil. a) gugus fosfat b) gula pentosa c) basa N Di antara ketiga komponen monomer asam nukleat tersebut di atas, hanya basa N-lah yang memungkinkan terjadinya variasi. Pada kenyataannya memang urutan (sekuens) basa N pada suatu molekul asam nukleat merupakan penentu bagi spesifisitasnya. Dengan perkataan lain, identifikasi asam nukleat dilakukan berdasarkan atas urutan basa N-nya sehingga secara skema kita bisa menggambarkan suatu molekul asam nukleat hanya dengan menuliskan urutan basanya saja. Nukleosida dan nukleotida Penomoran posisi atom C pada cincin gula dilakukan menggunakan tanda aksen (1’, 2’, dan seterusnya), sekedar untuk membedakannya dengan penomoran posisi pada cincin basa. Posisi 1’ pada gula akan berikatan dengan posisi 9 (N-9) pada basa purin atau posisi 1 (N-1) pada basa pirimidin melalui ikatan glikosidik atau glikosilik (Gambar 2.2). Kompleks gula-basa ini dinamakan nukleosida. Di atas telah disinggung bahwa asam nukleat tersusun dari monomer-monomer berupa nukleotida, yang masing-masing terdiri atas sebuah gugus fosfat, sebuah gula pentosa, dan sebuah basa N. Dengan demikian, setiap nukleotida pada asam nukleat dapat dilihat sebagai nukleosida monofosfat. Namun, pengertian nukleotida secara umum sebenarnya adalah nukleosida dengan sebuah atau lebih gugus fosfat. Sebagai contoh, molekul ATP (adenosin trifosfat) adalah nukleotida yang merupakan nukleosida dengan tiga gugus fosfat. Jika gula pentosanya adalah ribosa seperti halnya pada RNA, maka nukleosidanya dapat berupa adenosin, guanosin, sitidin, dan uridin. Begitu pula, nukleotidanya akan ada empat macam, yaitu adenosin monofosfat, guanosin monofosfat, sitidin monofosfat, dan uridin monofosfat. Sementara itu, jika gula pentosanya adalah deoksiribosa seperti halnya pada DNA, maka (2’-deoksiribo)nukleosidanya terdiri atas deoksiadenosin, deoksiguanosin, deoksisitidin, dan deoksitimidin. Ikatan fosfodiester Selain ikatan glikosidik yang menghubungkan gula pentosa dengan basa N, pada asam nukleat terdapat pula ikatan kovalen melalui gugus fosfat yang menghubungkan antara gugus hidroksil (OH) pada posisi 5’ gula pentosa dan gugus hidroksil pada posisi 3’ gula pentosa nukleotida berikutnya. Ikatan ini dinamakan ikatan fosfodiester karena secara kimia gugus fosfat berada dalam bentuk diester (Gambar 2.2). Oleh karena ikatan fosfodiester menghubungkan gula pada suatu nukleotida dengan gula pada nukleotida berikutnya, maka ikatan ini sekaligus menghubungkan kedua nukleotida yang berurutan tersebut. Dengan demikian, akan terbentuk suatu rantai polinukleotida yang masing-masing nukleotidanya satu sama lain dihubungkan oleh ikatan fosfodiester. Kecuali yang berbentuk sirkuler, seperti halnya pada kromosom dan plasmid bakteri, rantai polinukleotida memiliki dua ujung. Salah satu ujungnya berupa gugus fosfat yang terikat pada posisi 5’ gula pentosa. Oleh karena itu, ujung ini dinamakan ujung P atau ujung 5’. Ujung yang lainnya berupa gugus hidroksil yang terikat pada posisi 3’ gula pentosa sehingga ujung ini dinamakan ujung OH atau ujung 3’. Adanya ujung-ujung tersebut menjadikan rantai polinukleotida linier mempunyai arah tertentu. Pada pH netral adanya gugus fosfat akan menyebabkan asam nukleat bermuatan negatif. Inilah alasan pemberian nama ’asam’ kepada molekul polinukleotida meskipun di dalamnya juga terdapat banyak basa N. Kenyataannya, asam nukleat memang merupakan anion asam kuat atau merupakan polimer yang sangat bermuatan negatif. Sekuens asam nukleat Telah dikatakan di atas bahwa urutan basa N akan menentukan spesifisitas suatu molekul asam nukleat sehingga biasanya kita menggambarkan suatu molekul asam nukleat cukup dengan menuliskan urutan basa (sekuens)-nya saja. Selanjutnya, dalam penulisan sekuens asam nukleat ada kebiasaan untuk menempatkan ujung 5’ di sebelah kiri atau ujung 3’ di sebelah kanan. Sebagai contoh, suatu sekuens DNA dapat dituliskan 5’-ATGACCTGAAAC-3’ atau suatu sekuens RNA dituliskan 5’-GGUCUGAAUG-3’. Jadi, spesifisitas suatu asam nukleat selain ditentukan oleh sekuens basanya, juga harus dilihat dari arah pembacaannya. Dua asam nukleat yang memiliki sekuens sama tidak berarti keduanya sama jika pembacaan sekuens tersebut dilakukan dari arah yang berlawanan (yang satu 5’→ 3’, sedangkan yang lain 3’→ 5’). Struktur tangga berpilin (double helix) DNA Dua orang ilmuwan, J.D.Watson dan F.H.C.Crick, mengajukan model struktur molekul DNA yang hingga kini sangat diyakini kebenarannya dan dijadikan dasar dalam berbagai teknik yang berkaitan dengan manipulasi DNA. Model tersebut dikenal sebagai tangga berplilin (double helix). Secara alami DNA pada umumnya mempunyai struktur molekul tangga berpilin ini. Model tangga berpilin menggambarkan struktur molekul DNA sebagai dua rantai polinukleotida yang saling memilin membentuk spiral dengan arah pilinan ke kanan. Fosfat dan gula pada masing-masing rantai menghadap ke arah luar sumbu pilinan, sedangkan basa N menghadap ke arah dalam sumbu pilinan dengan susunan yang sangat khas sebagai pasangan – pasangan basa antara kedua rantai. Dalam hal ini, basa A pada satu rantai akan berpasangan dengan basa T pada rantai lainnya, sedangkan basa G berpasangan dengan basa C. Pasangan-pasangan basa ini dihubungkan oleh ikatan hidrogen yang lemah (nonkovalen). Basa A dan T dihubungkan oleh ikatan hidrogen rangkap dua, sedangkan basa G dan C dihubungkan oleh ikatan hidrogen rangkap tiga. Adanya ikatan hidrogen tersebut menjadikan kedua rantai polinukleotida terikat satu sama lain dan saling komplementer. Artinya, begitu sekuens basa pada salah satu rantai diketahui, maka sekuens pada rantai yang lainnya dapat ditentukan. Oleh karena basa bisiklik selalu berpasangan dengan basa monosiklik, maka jarak antara kedua rantai polinukleotida di sepanjang molekul DNA akan selalu tetap. Dengan perkataan lain, kedua rantai tersebut sejajar. Akan tetapi, jika rantai yang satu dibaca dari arah 5’ ke 3’, maka rantai pasangannya dibaca dari arah 3’ ke 5’. Jadi, kedua rantai tersebut sejajar tetapi berlawanan arah (antiparalel). Jarak antara dua pasangan basa yang berurutan adalah 0,34 nm. Sementara itu, di dalam setiap putaran spiral terdapat 10 pasangan basa sehingga jarak antara dua basa yang tegak lurus di dalam masing-masing rantai menjadi 3,4 nm. Namun, kondisi semacam ini hanya dijumpai apabila DNA berada dalam medium larutan fisiologis dengan kadar garam rendah seperti halnya yang terdapat di dalam protoplasma sel hidup. DNA semacam ini dikatakan berada dalam bentuk B atau bentuk yang sesuai dengan model asli Watson-Crick. Bentuk yang lain, misalnya bentuk A, akan dijumpai jika DNA berada dalam medium dengan kadar garam tinggi. Pada bentuk A terdapat 11 pasangan basa dalam setiap putaran spiral. Selain itu, ada pula bentuk Z, yaitu bentuk molekul DNA yang mempunyai arah pilinan spiral ke kiri. Bermacam-macam bentuk DNA ini sifatnya fleksibel, artinya dapat berubah dari yang satu ke yang lain bergantung kepada kondisi lingkungannya. Modifikasi struktur molekul RNA Tidak seperti DNA, molekul RNA pada umumnya berupa untai tunggal sehingga tidak memiliki struktur tangga berpilin. Namun, modifikasi struktur juga terjadi akibat terbentuknya ikatan hidrogen di dalam untai tunggal itu sendiri (intramolekuler). Dengan adanya modifikasi struktur molekul RNA, kita mengenal tiga macam RNA, yaitu RNA duta atau messenger RNA (mRNA), RNA pemindah atau transfer RNA (tRNA), dan RNA ribosomal (rRNA). Struktur mRNA dikatakan sebagai struktur primer, sedangkan struktur tRNA dan rRNA dikatakan sebagai struktur sekunder. Perbedaan di antara ketiga struktur molekul RNA tersebut berkaitan dengan perbedaan fungsinya masing-masing. Sifat-sifat Fisika-Kimia Asam Nukleat Di bawah ini akan dibicarakan sekilas beberapa sifat fisika-kimia asam nukleat. Sifat-sifat tersebut adalah stabilitas asam nukleat, pengaruh asam, pengaruh alkali, denaturasi kimia, viskositas, dan kerapatan apung. Stabilitas asam nukleat Ketika kita melihat struktur tangga berpilin molekul DNA atau pun struktur sekunder RNA, sepintas akan nampak bahwa struktur tersebut menjadi stabil akibat adanya ikatan hidrogen di antara basa-basa yang berpasangan. Padahal, sebenarnya tidaklah demikian. Ikatan hidrogen di antara pasangan-pasangan basa hanya akan sama kuatnya dengan ikatan hidrogen antara basa dan molekul air apabila DNA berada dalam bentuk rantai tunggal. Jadi, ikatan hidrogen jelas tidak berpengaruh terhadap stabilitas struktur asam nukleat, tetapi sekedar menentukan spesifitas perpasangan basa. Penentu stabilitas struktur asam nukleat terletak pada interaksi penempatan (stacking interactions) antara pasangan-pasangan basa. Permukaan basa yang bersifat hidrofobik menyebabkan molekul-molekul air dikeluarkan dari sela-sela perpasangan basa sehingga perpasangan tersebut menjadi kuat. Pengaruh asam Di dalam asam pekat dan suhu tinggi, misalnya HClO4 dengan suhu lebih dari 100ºC, asam nukleat akan mengalami hidrolisis sempurna menjadi komponen-komponennya. Namun, di dalam asam mineral yang lebih encer, hanya ikatan glikosidik antara gula dan basa purin saja yang putus sehingga asam nukleat dikatakan bersifat apurinik. Pengaruh alkali Pengaruh alkali terhadap asam nukleat mengakibatkan terjadinya perubahan status tautomerik basa. Sebagai contoh, peningkatan pH akan menyebabkan perubahan struktur guanin dari bentuk keto menjadi bentuk enolat karena molekul tersebut kehilangan sebuah proton. Selanjutnya, perubahan ini akan menyebabkan terputusnya sejumlah ikatan hidrogen sehingga pada akhirnya rantai ganda DNA mengalami denaturasi. Hal yang sama terjadi pula pada RNA. Bahkan pada pH netral sekalipun, RNA jauh lebih rentan terhadap hidrolisis bila dibadingkan dengan DNA karena adanya gugus OH pada atom C nomor 2 di dalam gula ribosanya. Denaturasi kimia Sejumlah bahan kimia diketahui dapat menyebabkan denaturasi asam nukleat pada pH netral. Contoh yang paling dikenal adalah urea (CO(NH2)2) dan formamid (COHNH2). Pada konsentrasi yang relatif tinggi, senyawa-senyawa tersebut dapat merusak ikatan hidrogen. Artinya, stabilitas struktur sekunder asam nukleat menjadi berkurang dan rantai ganda mengalami denaturasi. Viskositas DNA kromosom dikatakan mempunyai nisbah aksial yang sangat tinggi karena diameternya hanya sekitar 2 nm, tetapi panjangnya dapat mencapai beberapa sentimeter. Dengan demikian, DNA tersebut berbentuk tipis memanjang. Selain itu, DNA merupakan molekul yang relatif kaku sehingga larutan DNA akan mempunyai viskositas yang tinggi. Karena sifatnya itulah molekul DNA menjadi sangat rentan terhadap fragmentasi fisik. Hal ini menimbulkan masalah tersendiri ketika kita hendak melakukan isolasi DNA yang utuh. Kerapatan apung Analisis dan pemurnian DNA dapat dilakukan sesuai dengan kerapatan apung (bouyant density)-nya. Di dalam larutan yang mengandung garam pekat dengan berat molekul tinggi, misalnya sesium klorid (CsCl) 8M, DNA mempunyai kerapatan yang sama dengan larutan tersebut, yakni sekitar 1,7 g/cm3. Jika larutan ini disentrifugasi dengan kecepatan yang sangat tinggi, maka garam CsCl yang pekat akan bermigrasi ke dasar tabung dengan membentuk gradien kerapatan. Begitu juga, sampel DNA akan bermigrasi menuju posisi gradien yang sesuai dengan kerapatannya. Teknik ini dikenal sebagai sentrifugasi seimbang dalam tingkat kerapatan (equilibrium density gradient centrifugation) atau sentrifugasi isopiknik. Oleh karena dengan teknik sentrifugasi tersebut pelet RNA akan berada di dasar tabung dan protein akan mengapung, maka DNA dapat dimurnikan baik dari RNA maupun dari protein. Selain itu, teknik tersebut juga berguna untuk keperluan analisis DNA karena kerapatan apung DNA (ρ) merupakan fungsi linier bagi kandungan GC-nya. Dalam hal ini, ρ = 1,66 + 0,098% (G + C). Sifat-sifat Spektroskopik-Termal Asam Nukleat Sifat spektroskopik-termal asam nukleat meliputi kemampuan absorpsi sinar UV, hipokromisitas, penghitungan konsentrasi asam nukleat, penentuan kemurnian DNA, serta denaturasi termal dan renaturasi asam nukleat. Masing-masing akan dibicarakan sekilas berikut ini. Absorpsi UV Asam nukleat dapat mengabsorpsi sinar UV karena adanya basa nitrogen yang bersifat aromatik; fosfat dan gula tidak memberikan kontribusi dalam absorpsi UV. Panjang gelombang untuk absorpsi maksimum baik oleh DNA maupun RNA adalah 260 nm atau dikatakan λmaks = 260 nm. Nilai ini jelas sangat berbeda dengan nilai untuk protein yang mempunyai λmaks = 280 nm. Sifat-sifat absorpsi asam nukleat dapat digunakan untuk deteksi, kuantifikasi, dan perkiraan kemurniannya. Hipokromisitas Meskipun λmaks untuk DNA dan RNA konstan, ternyata ada perbedaan nilai yang bergantung kepada lingkungan di sekitar basa berada. Dalam hal ini, absorbansi pada λ 260 nm (A260) memperlihatkan variasi di antara basa-basa pada kondisi yang berbeda. Nilai tertinggi terlihat pada nukleotida yang diisolasi, nilai sedang diperoleh pada molekul DNA rantai tunggal (ssDNA) atau RNA, dan nilai terendah dijumpai pada DNA rantai ganda (dsDNA). Efek ini disebabkan oleh pengikatan basa di dalam lingkungan hidrofobik. Istilah klasik untuk menyatakan perbedaan nilai absorbansi tersebut adalah hipokromisitas. Molekul dsDNA dikatakan relatif hipokromik (kurang berwarna) bila dibandingkan dengan ssDNA. Sebaliknya, ssDNA dikatakan hiperkromik terhadap dsDNA. Penghitungan konsentrasi asam nukleat Konsentrasi DNA dihitung atas dasar nilai A260-nya. Molekul dsDNA dengan konsentrasi 1mg/ml mempunyai A260 sebesar 20, sedangkan konsentrasi yang sama untuk molekul ssDNA atau RNA mempunyai A260 lebih kurang sebesar 25. Nilai A260 untuk ssDNA dan RNA hanya merupakan perkiraan karena kandungan basa purin dan pirimidin pada kedua molekul tersebut tidak selalu sama, dan nilai A260 purin tidak sama dengan nilai A260 pirimidin. Pada dsDNA, yang selalu mempunyai kandungan purin dan pirimidin sama, nilai A260 -nya sudah pasti. Kemurnian asam nukleat Tingkat kemurnian asam nukleat dapat diestimasi melalui penentuan nisbah A260 terhadap A280. Molekul dsDNA murni mempunyai nisbah A260 /A280 sebesar 1,8. Sementara itu, RNA murni mempunyai nisbah A260 /A280 sekitar 2,0. Protein, dengan λmaks = 280 nm, tentu saja mempunyai nisbah A260 /A280 kurang dari 1,0. Oleh karena itu, suatu sampel DNA yang memperlihatkan nilai A260 /A280 lebih dari 1,8 dikatakan terkontaminasi oleh RNA. Sebaliknya, suatu sampel DNA yang memperlihatkan nilai A260 /A280 kurang dari 1,8 dikatakan terkontaminasi oleh protein. Denaturasi termal dan renaturasi Di atas telah disinggung bahwa beberapa senyawa kimia tertentu dapat menyebabkan terjadinya denaturasi asam nukleat. Ternyata, panas juga dapat menyebabkan denaturasi asam nukleat. Proses denaturasi ini dapat diikuti melalui pengamatan nilai absorbansi yang meningkat karena molekul rantai ganda (pada dsDNA dan sebagian daerah pada RNA) akan berubah menjadi molekul rantai tunggal. Denaturasi termal pada DNA dan RNA ternyata sangat berbeda. Pada RNA denaturasi berlangsung perlahan dan bersifat acak karena bagian rantai ganda yang pendek akan terdenaturasi lebih dahulu daripada bagian rantai ganda yang panjang. Tidaklah demikian halnya pada DNA. Denaturasi terjadi sangat cepat dan bersifat koperatif karena denaturasi pada kedua ujung molekul dan pada daerah kaya AT akan mendestabilisasi daerah-daerah di sekitarnya. Suhu ketika molekul asam nukleat mulai mengalami denaturasi dinamakan titik leleh atau melting temperature (Tm). Nilai Tm merupakan fungsi kandungan GC sampel DNA, dan berkisar dari 80 ºC hingga 100ºC untuk molekul-molekul DNA yang panjang. DNA yang mengalami denaturasi termal dapat dipulihkan (direnaturasi) dengan cara didinginkan. Laju pendinginan berpengaruh terhadap hasil renaturasi yang diperoleh. Pendinginan yang berlangsung cepat hanya memungkinkan renaturasi pada beberapa bagian/daerah tertentu. Sebaliknya, pendinginan yang dilakukan perlahan-lahan dapat mengembalikan seluruh molekul DNA ke bentuk rantai ganda seperti semula. Renaturasi yang terjadi antara daerah komplementer dari dua rantai asam nukleat yang berbeda dinamakan hibridisasi. Superkoiling DNA Banyak molekul dsDNA berada dalam bentuk sirkuler tertutup atau closed-circular (CC), misalnya DNA plasmid dan kromosom bakteri serta DNA berbagai virus. Artinya, kedua rantai membentuk lingkaran dan satu sama lain dihubungkan sesuai dengan banyaknya putaran heliks (Lk) di dalam molekul DNA tersebut. Sejumlah sifat muncul dari kondisi sirkuler DNA. Cara yang baik untuk membayangkannya adalah menganggap struktur tangga berpilin DNA seperti gelang karet dengan suatu garis yang ditarik di sepanjang gelang tersebut. Jika kita membayangkan suatu pilinan pada gelang, maka deformasi yang terbentuk akan terkunci ke dalam sistem pilinan tersebut. Deformasi inilah yang disebut sebagai superkoiling. Interkalator Geometri suatu molekul yang mengalami superkoiling dapat berubah akibat beberapa faktor yang mempengaruhi pilinan internalnya. Sebagai contoh, peningkatan suhu dapat menurunkan jumlah pilinan, atau sebaliknya, peningkatan kekuatan ionik dapat menambah jumlah pilinan. Salah satu faktor yang penting adalah keberadaan interkalator seperti etidium bromid (EtBr). Molekul ini merupakan senyawa aromatik polisiklik bermuatan positif yang menyisip di antara pasangan-pasangan basa. Dengan adanya EtBr molekul DNA dapat divisualisasikan menggunakan paparan sinar UV. 2. Replikasi DNA Replikasi DNA adalah proses penggandaan molekul DNA untai ganda. Pada sel, replikasi DNA terjadi sebelum pembelahan sel. Prokariota terus-menerus melakukan replikasi DNA. Pada eukariota, waktu terjadinya replikasi DNA sangatlah diatur, yaitu pada fase S daur sel, sebelum mitosis atau meiosis I. Penggandaan tersebut memanfaatkan enzim DNA polimerase yang membantu pembentukan ikatan antara nukleotida-nukleotida penyusun polimer DNA. Proses replikasi DNA dapat pula dilakukan in vitro dalam proses yang disebut reaksi berantai polimerase (PCR). Garpu replikasi Garpu replikasi atau cabang replikasi (replication fork) ialah struktur yang terbentuk ketika DNA bereplikasi. Garpu replikasi ini dibentuk akibat enzim helikase yang memutus ikatan-ikatan hidrogen yang menyatukan kedua untaian DNA, membuat terbukanya untaian ganda tersebut menjadi dua cabang yang masing-masing terdiri dari sebuah untaian tunggal DNA. Masing-masing cabang tersebut menjadi "cetakan" untuk pembentukan dua untaian DNA baru berdasarkan urutan nukleotida komplementernya. DNA polimerase membentuk untaian DNA baru dengan memperpanjang oligonukleotida (RNA) yang dibentuk oleh enzim primase dan disebut primer. Replikasi DNA bersifat semikonservatif, yaitu kedua untai tunggal DNA bertindak sebagai cetakan untuk pembuatan untai-untai DNA baru; seluruh untai tunggal cetakan dipertahankan dan untai yang baru dibuat dari nukleotida-nukleotida. DNA polimerase membentuk untaian DNA baru dengan menambahkan nukleotida—dalam hal ini, deoksiribonukleotida—ke ujung 3'-hidroksil bebas nukleotida rantai DNA yang sedang tumbuh. Dengan kata lain, rantai DNA baru (DNA "anak") disintesis dari arah 5'→3', sedangkan DNA polimerase bergerak pada DNA "induk" dengan arah 3'→5'. Namun demikian, salah satu untaian DNA induk pada garpu replikasi berorientasi 3'→5', sementara untaian lainnya berorientasi 5'→3', dan helikase bergerak membuka untaian rangkap DNA dengan arah 5'→3'. Oleh karena itu, replikasi harus berlangsung pada kedua arah berlawanan tersebut. Replikasi DNA. Mula-mula, heliks ganda DNA (merah) dibuka menjadi dua untai tunggal oleh enzim helikase (9) dengan bantuan topoisomerase (11) yang mengurangi tegangan untai DNA. Untaian DNA tunggal dilekati oleh protein-protein pengikat untaian tunggal (10) untuk mencegahnya membentuk heliks ganda kembali. Primase (6) membentuk oligonukleotida RNA yang disebut primer (5) dan molekul DNA polimerase (3 & 8) melekat pada seuntai tunggal DNA dan bergerak sepanjang untai tersebut memperpanjang primer, membentuk untaian tunggal DNA baru yang disebut leading strand (2) dan lagging strand (1). DNA polimerase yang membentuk lagging strand harus mensintesis segmen-segmen polinukleotida diskontinu (disebut fragmen Okazaki (7)). Enzim DNA ligase (4) kemudian menyambungkan potongan-potongan lagging strand tersebut. Pembentukan leading strand Pada replikasi DNA, untaian pengawal (leading strand) ialah untaian DNA yang disintesis dengan arah 5'→3' secara berkesinambungan. Pada untaian ini, DNA polimerase mampu membentuk DNA menggunakan ujung 3'-OH bebas dari sebuah primer RNA dan sintesis DNA berlangsung secara berkesinambungan, searah dengan arah pergerakan garpu replikasi. Pembentukan lagging strand Lagging strand ialah untaian DNA yang terletak pada sisi yang berseberangan dengan leading strand pada garpu replikasi. Untaian ini disintesis dalam segmen-segmen yang disebut fragmen Okazaki. Pada untaian ini, primase membentuk primer RNA. DNA polimerase dengan demikian dapat menggunakan gugus OH 3' bebas pada primer RNA tersebut untuk mensintesis DNA dengan arah 5'→3'. Fragmen primer RNA tersebut lalu disingkirkan (misalnya dengan RNase H dan DNA Polimerase I) dan deoksiribonukleotida baru ditambahkan untuk mengisi celah yang tadinya ditempati oleh RNA. DNA ligase lalu menyambungkan fragmen-fragmen Okazaki tersebut sehingga sintesis lagging strand menjadi lengkap. 3. Transkripsi dan Translasi Gen Transkripsi (dari bahasa Inggris: transcription) dalam genetika adalah pembuatan RNA dengan menyalin sebagian berkas DNA. Transkripsi adalah bagian dari rangkaian ekspresi genetik. Pengertian asli "transkripsi" adalah alih aksara atau penyalinan. Di sini, yang dimaksud adalah mengubah "teks" DNA menjadi RNA. Sebenarnya, yang berubah hanyalah basa nitrogen timin di DNA yang pada RNA digantikan oleh urasil Proses Transkripsi berlangsung di dalam inti sel (nukleus) atau di dalam matriks pada mitokondria dan plastida. Transkripsi dapat dipicu oleh rangsangan dari luar maupun tanpa rangsangan. Pada proses tanpa rangsangan, transkripsi berlangsung terus-menerus (gen-gennya disebut gen konstitutif atau "gen pengurus rumah", house-keeping genes). Sementara itu, gen yang memerlukan rangsangan biasanya gen yang hanya diproduksi sewaktu-waktu; gennya disebut gen regulatorik karena biasanya mengatur mekanisme khusus. Rangsangan akan mengaktifkan bagian promoter. Promoter ini terletak di bagian hulu bagian yang akan disalin (disebut transcription unit). Proses transkripsi diawali oleh mobilisasi sejumlah protein, beberapa di antaranya enzim. Selanjutnya, protein-protein non-enzim, disebut faktor transkripsi, menempati posisi-posisi DNA tertentu (karena memiliki "tanda pengenal") yang pada gilirannya membuat DNA siap melakukan transkripsi. Bagian ini dikenal sebagai TATA-box, terletak sekitar 10-25 pasangan basa di bagian hulu (upstream) dari kodon mulai (AUG). Adanya faktor transkripsi ini akan menarik enzim RNA polimerase mendekat ke DNA dan kemudian menempatkan diri pada tempat yang sesuai dengan kodon mulai (TAC pada berkas DNA). Berkas DNA yang ditempel oleh RNA polimerase disebut sebagai berkas templat, sementara berkas pasangannya disebut sebagai berkas kode (karena memiliki urutan basa yang sama dengan RNA yang dibuat). Sejumlah ATP diperlukan untuk membuat RNA polimerase mulai bergerak dari ujung 3' (ujung karboksil) berkas templat ke arah ujung 5' (ujung amino). RNA yang terbentuk dengan demikian berarah 5' → 3'. Pergerakan RNA polimerase akan berhenti apabila ia menemui urutan basa yang sesuai dengan kodon berhenti. Setelah proses selesai, RNA polimerase akan lepas dari DNA. Tergantung intensitasnya, dalam satu berkas transcription unit sejumlah RNA polimerase dapat bekerja secara simultan. Intensitas transkripsi ditentukan oleh keadaan di sejumlah bagian tertentu pada DNA. Ada bagian yang disebut suppressor yang menekan intensitas, dan ada yang disebut enhancer yang memperkuatnya. Hasil Hasil transkripsi adalah berkas RNA yang masih "mentah". Di dalamnya terdapat fragmen berkas untuk protein yang mengatur dan membantu sintesis protein (translasi) selain fragmen untuk dilanjutkan dalam translasi sendiri, ditambah dengan bagian yang nantinya akan dipotong (intron). Berkas RNA ini selanjutnya akan mengalami proses yang disebut sebagai proses pascatranskripsi (post-transcriptional process). 4. Ekspresi Gen Mekanisme Pengaturan Ekspresi Gen Produk-produk gen tertentu seperti protein ribosomal, rRNA, tRNA, RNA polimerase, dan enzim-enzim yang mengatalisis berbagai reaksi metabolisme yang berkaitan dengan fungsi pemeliharaan sel merupakan komponen esensial bagi semua sel. Gen-gen yang menyandi pembentukan produk semacam itu perlu diekspresikan terus-menerus sepanjang umur individu di hampir semua jenis sel tanpa bergantung kepada kondisi lingkungan di sekitarnya. Sementara itu, banyak pula gen lainnya yang ekspresinya sangat ditentukan oleh kondisi lingkungan sehingga mereka hanya akan diekspresikan pada waktu dan di dalam jenis sel tertentu. Untuk gen-gen semacam ini harus ada mekanisme pengaturan ekspresinya. Pengaturan ekspresi gen dapat terjadi pada berbagai tahap, misalnya transkripsi, prosesing mRNA, atau translasi. Namun, sejumlah data hasil penelitian menunjukkan bahwa pengaturan ekspresi gen, khususnya pada prokariot, paling banyak terjadi pada tahap transkripsi. Mekanisme pengaturan transkripsi, baik pada prokariot maupun pada eukariot, secara garis besar dapat dibedakan menjadi dua kategori utama, yaitu (1) mekanisme yang melibatkan penyalapadaman (turn on and turn off) ekspresi gen sebagai respon terhadap perubahan kondisi lingkungan dan (2) sirkit ekspresi gen yang telah terprogram (preprogramed circuits). Mekanisme penyalapadaman sangat penting bagi mikroorganisme untuk menyesuaikan diri terhadap perubahan lingkungan yang seringkali terjadi secara tiba-tiba. Sebaliknya, bagi eukariot mekanisme ini nampaknya tidak terlalu penting karena pada organisme ini sel justru cenderung merespon sinyal-sinyal yang datang dari dalam tubuh, dan di sisi lain, sistem sirkulasi akan menjadi penyangga bagi sel terhadap perubahan kondisi lingkungan yang mendadak tersebut. Pada mekanisme sirkit, produk suatu gen akan menekan transkripsi gen itu sendiri dan sekaligus memacu transkripsi gen kedua, produk gen kedua akan menekan transkripsi gen kedua dan memacu transkripsi gen ketiga, demikian seterusnya. Ekspresi gen yang berurutan ini telah terprogram secara genetik sehingga gen-gen tersebut tidak akan dapat diekspresikan di luar urutan. Oleh karena urutan ekspresinya berupa sirkit, maka mekanisme tersebut dinamakan sirkit ekspresi gen. Induksi dan Represi pada Prokariot Escherichia coli merupakan bakteri yang sering dijadikan model untuk mempelajari berbagai mekanisme genetika molekuler. Bakteri ini secara alami hidup di dalam usus besar manusia dengan memanfaatkan sumber karbon yang umumnya berupa glukosa. Apabila suatu ketika E. coli ditumbuhkan pada medium yang sumber karbonnya bukan glukosa melainkan laktosa, maka enzim pemecah laktosa akan disintesis, sesuatu yang tidak biasa dilakukannya. Untuk itu, gen-gen penyandi berbagai enzim yang terlibat dalam pemanfaatan laktosa akan diekspresikan (turned on). Sebaliknya, dalam keadaan normal, yaitu ketika tersedia glukosa sebagai sumber karbon, maka gen-gen tersebut tidak diekspresikan (turned off). Proses yang terjadi ketika ekspresi gen merupakan respon terhadap keberadaan suatu zat di lingkungannya dikenal sebagai induksi, sedangkan zat atau molekul yang menyebabkan terjadinya induksi disebut sebagai induser. Jadi, dalam contoh ini laktosa merupakan induser. Induksi secara molekuler terjadi pada tingkat transkripsi. Peristiwa ini berkenaan dengan laju sintesis enzim, bukan dengan aktivitas enzim. Pada pengaktifan enzim suatu molekul kecil akan terikat pada enzim sehingga akan terjadi peningkatan aktivitas enzim tersebut, bukan peningkatan laju sintesisnya. Selain mempunyai kemampuan untuk memecah suatu molekul (katabolisme), bakteri juga dapat menyintesis (anabolisme) berbagai molekul organik yang diperlukan bagi pertumbuhannya. Sebagai contoh, Salmonella typhimurium mempunyai sejumlah gen yang menyandi enzim-enzim untuk biosintesis triptofan. Dalam medium pertumbuhan yang tidak mengandung triptofan, S. typhimurium akan mengekspresikan (turned on) gen-gen tersebut. Akan tetapi, jika suatu saat ke dalam medium pertumbuhannya ditambahkan triptofan, maka gen-gen tersebut tidak perlu diekspresikan (turned off). Proses pemadaman (turn off) ekspresi gen sebagai respon terhadap keberadaan suatu zat di lingkungannya dinamakan represi, sedangkan zat yang menyebabkan terjadinya represi disebut sebagai korepresor. Jadi, dalam contoh ini triptofan merupakan korepresor. Seperti halnya induksi, represi juga terjadi pada tahap transkripsi. Represi sering dikacaukan dengan inhibisi umpan balik (feedback inhibition), yaitu penghambatan aktivitas enzim akibat pengikatan produk akhir reaksi yang dikatalisis oleh enzim itu sendiri. Represi tidak menghambat aktivitas enzim, tetapi menekan laju sintesisnya. Model operon Mekanisme molekuler induksi dan represi telah dapat dijelaskan menurut model yang diajukan oleh F. Jacob dan J. Monod pada tahun 1961. Menurut model yang dikenal sebagai operon ini ada dua unsur yang mengatur transkripsi gen struktural penyandi enzim, yaitu gen regulator (gen represor) dan operator yang letaknya berdekatan dengan gen-gen struktural yang diaturnya. Gen regulator menyandi pembentukan suatu protein yang dinamakan represor. Pada kondisi tertentu represor akan berikatan dengan operator, menyebabkan terhalangnya transkripsi gen-gen struktural. Hal ini terjadi karena enzim RNA polimerase tidak dapat memasuki promoter yang letaknya berdekatan, atau bahkan tumpang tindih, dengan operator. Secara keseluruhan setiap operon terdiri atas promoter operon atau promoter bagi gen-gen struktural (PO), operator (O), dan gen-gen struktural (GS). Di luar operon terdapat gen regulator (R) beserta promoternya (PR), molekul protein represor yang dihasilkan oleh gen regulator, dan molekul efektor. Molekul efektor pada induksi adalah induser, sedangkan pada represi adalah korepresor. Pada induksi represor secara normal akan berikatan dengan operator sehingga RNA polimerase tidak dapat memasuki promoter operon. Akibatnya, transkripsi gen-gen struktural tidak dapat berlangsung. Namun, dengan terikatnya represor oleh induser, promoter operon menjadi terbuka bagi RNA polimerase sehingga gen-gen struktural dapat ditranskripsi dan selanjutnya ditranslasi. Dengan demikian, gen-gen struktural akan diekspresikan apabila terdapat molekul induser yang mengikat represor. Operon yang terdiri atas gen-gen yang ekspresinya terinduksi dinamakan operon induksi. Salah satu contohnya adalah operon lac, yang terdiri atas gen-gen penyandi enzim pemecah laktosa seperti telah disebutkan di atas. Sebaliknya, pada represi secara normal represor tidak berikatan dengan operator sehingga RNA polimerase dapat memasuki promoter operon dan transkripsi gen-gen struktural dapat terjadi. Akan tetapi, dengan adanya korepresor, akan terbentuk kompleks represor-korepresor yang kemudian berikatan dengan operator. Dengan pengikatan ini, RNA polimerase tidak dapat memasuki promoter operon sehingga transkripsi gen-gen struktural menjadi terhalang. Jadi, ekspresi gen-gen struktural akan terepresi apabila terdapat molekul korepresor yang berikatan dengan represor. Gen-gen yang ekspresinya dapat terepresi merupakan komponen operon yang dinamakan operon represi. Operon trp, yang terdiri atas gen-gen penyandi enzim untuk biosintesis triptofan merupakan contoh operon represi. Pengaturan Ekspresi Gen pada Eukariot Hingga sekarang kita baru sedikit sekali mengetahui mekanisme pengaturan ekspresi gen pada eukariot. Namun, kita telah mengetahui bahwa pada eukariot tingkat tinggi gen-gen yang berbeda akan ditranskripsi pada jenis sel yang berbeda. Hal ini menunjukkan bahwa mekanisme pengaturan pada tahap transkripsi, dan juga prosesing mRNA, memegang peran yang sangat penting dalam proses diferensiasi sel. Operon, kalau pun ada, nampaknya tidak begitu penting pada eukariot. Hanya pada eukariot tingkat rendah seperti jamur dapat ditemukan satuan-satuan operon atau mirip operon. Semua mRNA pada eukariot tingkat tinggi adalah monosistronik, yaitu hanya membawa urutan sebuah gen struktural. Transkrip primer yang adakalanya menyerupai polisistronik pun akan diproses menjadi mRNA yang monosistronik. Selain itu, terindikasi juga bahwa diferensiasi sel sedikit banyak melibatkan ekspresi seperangkat gen yang telah terprogram (preprogramed). Berbagai macam sinyal seperti molekul-molekul sitoplasmik, hormon, dan rangsangan dari lingkungan memicu dimulainya pembacaan program-program dengan urutan tertentu pada waktu dan tempat yang tepat selama perkembangan individu. Bukti paling nyata mengenai adanya keharusan urutan pembacaan program pada waktu dan tempat tertentu dapat dilihat pada kasus mutasi yang terjadi pada lalat Drosophila, misalnya munculnya sayap di kepala di tempat yang seharusnya untuk mata. Dengan mempelajari mutasi-mutasi semacam ini diharapkan akan diperoleh pengetahuan tentang mekanisme pengaturan ekspresi gen selama perkembangan normal individu. Pada eukariot tingkat tinggi kurang dari 10 persen gen yang terdapat di dalam seluruh genom akan terepresentasikan urutan basanya di antara populasi mRNA yang telah mengalami prosesing. Sebagai contoh, hanya ada dua hingga lima persen urutan DNA mencit yang akan terepresentasikan pada mRNA di dalam sel-sel hatinya. Demikian pula, mRNA di dalam sel-sel otak katak Xenopus hanya merepresentasikan delapan persen urutan DNAnya. Jadi, sebagian besar urutan basa DNA di dalam genom eukariot tingkat tinggi tidak terepresentasikan di antara populasi mRNA yang ada di dalam sel atau jaringan tertentu. Dengan perkataan lain, molekul mRNA yang dihasilkan dari perangkat gen yang berbeda akan dijumpai di dalam sel atau jaringan yang berbeda pula. Dosis gen dan amplifikasi gen Kebutuhan akan produk-produk gen pada eukariot dapat sangat bervariasi. Beberapa produk gen dibutuhkan dalam jumlah yang jauh lebih besar daripada produk gen lainnya sehingga terdapat nisbah kebutuhan di antara produk-produk gen yang berbeda. Untuk memenuhi nisbah kebutuhan ini antara lain dapat ditempuh melalui dosis gen. Katakanlah, ada gen A dan gen B yang ditranskripsi dan ditranslasi dengan efisiensi yang sama. Produk gen A dapat 20 kali lebih banyak daripada produk gen B apabila terdapat 20 salinan (kopi) gen A untuk setiap salinan gen B. Contoh yang nyata dapat dilihat pada gen-gen penyandi histon. Untuk menyintesis histon dalam jumlah besar yang dibutuhkan dalam pembentukan kromatin, kebanyakan sel mempunyai beratus-ratus kali salinan gen histon daripada jumlah salinan gen yang diperlukan untuk replikasi DNA. Salah satu pengaruh dosis gen adalah amplifikasi gen, yaitu peningkatan jumlah gen sebagai respon terhadap sinyal tertentu. Sebagai contoh, amplifikasi gen terjadi selama perkembangan oosit katak Xenopus laevis. Pembentukan oosit dari prekursornya (oogonium) merupakan proses kompleks yang membutuhkan sejumlah besar sintesis protein. Untuk itu dibutuhkan sejumlah besar ribosom. Kita mengetahui bahwa ribosom antara lain terdiri atas molekul-molekul rRNA. Padahal, sel-sel prekursor tidak mempunyai gen penyandi rRNA dalam jumlah yang mencukupi untuk sintesis molekul tersebut dalam waktu yang relatif singkat. Namun, sejalan dengan perkembangan oosit terjadi peningkatan jumlah gen rRNA hingga 4000 kali sehingga dari sebanyak 600 gen yang ada pada prekursor akan diperoleh sekitar dua juta gen setelah amplifikasi. Jika sebelum amplifikasi ke-600 gen rRNA berada di dalam satu segmen DNA linier, maka selama dan setelah amplifikasi gen tersebut akan berada di dalam gulungan-gulungan kecil yang mengalami replikasi. Molekul rRNA tidak diperlukan lagi ketika oosit telah matang hingga saat terjadinya fertilisasi. Oleh karena itu, gen rRNA yang telah begitu banyak disalin kemudian didegradasi kembali oleh berbagai enzim intrasel. Jika waktu yang tersedia untuk melakukan sintesis sejumlah besar protein cukup banyak, amplifikasi gen sebenarnya tidak perlu dilakukan. Cara lain untuk mengatasi kebutuhan protein tersebut adalah dengan meningkatkan masa hidup mRNA (lihat bagian pengaturan translasi). Pengaturan transkripsi Berdasarkan atas banyaknya salinan di dalam tiap sel, molekul mRNA dapat dibagi menjadi tiga kelompok, yaitu (1) mRNA salinan tunggal (single copy), (2) mRNA semiprevalen dengan jumlah salinan lebih dari satu hingga beberapa ratus per sel, dan (3) mRNA superprevalen dengan jumlah salinan beberapa ratus hingga beberapa ribu per sel. Molekul mRNA salinan tunggal dan semiprevalen masing-masing menyandi enzim dan protein struktural. Sementara itu, mRNA superprevalen biasanya dihasilkan sejalan dengan terjadinya perubahan di dalam suatu tahap perkembangan organisme eukariot. Sebagai contoh, sel-sel eritroblas di dalam sumsum tulang belakang mempunyai sejumlah besar mRNA yang dapat ditranslasi menjadi globin matang. Di sisi lain, hanya sedikit sekali atau bahkan tidak ada globin yang dihasilkan oleh sel-sel prekursor yang belum berkembang menjadi eritroblas. Dengan demikian, kita dapat memastikan adanya suatu mekanisme pengaturan ekspresi gen penyandi mRNA superprevalen pada tahap transkripsi eukariot meskipun hingga kini belum terlalu banyak rincian prosesnya yang dapat diungkapkan. Salah satu regulator yang diketahui berperan dalam transkripsi eukariot adalah hormon, molekul protein kecil yang dibawa dari sel tertentu menuju ke sel target. Mekanisme kerja hormon dalam mengatur transkripsi eukariot lebih kurang dapat disetarakan dengan induksi pada prokariot. Namun, penetrasi hormon ke dalam sel target dan pengangkutannya ke dalam nukleus merupakan proses yang jauh lebih rumit bila dibandingkan dengan induksi oleh laktosa pada E. coli. Secara garis besar pengaturan transkripsi oleh hormon dimulai dengan masuknya hormon ke dalam sel target melewati membran sel, yang kemudian ditangkap oleh reseptor khusus yang terdapat di dalam sitoplasma sehingga terbentuk kompleks hormon-reseptor. Setelah kompleks ini terbentuk biasanya reseptor akan mengalami modifikasi struktur kimia. Kompleks hormon-reseptor yang termodifikasi kemudian menembus dinding nukleus untuk memasuki nukleus. Proses selanjutnya belum banyak diketahui, tetapi rupanya di dalam nukleus kompleks tersebut, atau mungkin hormonnya saja, akan mengalami salah satu di antara beberapa peristiwa, yaitu (1) pengikatan langsung pada DNA, (2) pengikatan pada suatu protein efektor, (3) aktivasi protein yang terikat DNA, (4) inaktivasi represor, dan (5) perubahan struktur kromatin agar DNA terbuka bagi enzim RNA polimerase. Contoh induksi transkripsi oleh hormon antara lain dapat dilihat pada stimulasi sintesis ovalbumin pada saluran telur (oviduktus) ayam oleh hormon kelamin estrogen. Jika ayam disuntik dengan estrogen, jaringan-jaringan oviduktus akan memberikan respon berupa sintesis mRNA untuk ovalbumin. Sintesis ini akan terus berlanjut selama estrogen diberikan, dan hanya sel-sel oviduktus yang akan menyintesis mRNA tersebut. Hal ini karena sel-sel atau jaringan lainnya tidak mempunyai reseptor hormon estrogen di dalam sitoplasmanya. Pengaturan pada tahap prosesing mRNA Dua jenis sel yang berbeda dapat membuat protein yang sama tetapi dalam jumlah yang berbeda meskipun transkripsi di dalam kedua sel tersebut terjadi pada gen yang sama. Fenomena ini seringkali berkaitan dengan adanya molekul-molekul mRNA yang berbeda, yang akan ditranslasi dengan efisiensi berbeda pula. Pada tikus, misalnya, ditemukan bahwa perbedaan sintesis enzim α-amilase oleh berbagai mRNA yang berasal dari gen yang sama dapat terjadi karena adanya perbedaan pola pembuangan intron. Kelenjar ludah menghasilkan α-amilase lebih banyak daripada yang dihasilkan oleh jaringan hati meskipun gen yang ditranskripsi sama. Jadi, dalam hal ini transkrip primernya sebenarnya sama, tetapi kemudian ada perbedaan mekanisme prosesing, khususnya pada penyatuan (splicing) mRNA. Pengaturan translasi Berbeda dengan translasi mRNA pada prokariot yang terjadi dalam jumlah yang lebih kurang sama, pada eukariot ada mekanisme pengaturan translasi. Macam-macam pengaturan tersebut adalah (1) kondisi bahwa mRNA tidak akan ditranslasi sama sekali sebelum datangnya suatu sinyal, (2) pengaturan umur (lifetime) molekul mRNA, dan (3) pengaturan laju seluruh sintesis protein. Telur yang tidak dibuahi secara biologi bersifat statis. Akan tetapi, begitu fertilisasi terjadi, sejumlah protein akan disintesis. Hal ini menunjukkan bahwa di dalam sel telur yang belum dibuahi akan dijumpai sejumlah mRNA yang menantikan datangnya sinyal untuk translasi. Sinyal tersebut tidak lain adalah fertilisasi oleh spermatozoon, sedangkan molekul mRNA yang belum ditranslasi itu dinamakan mRNA tersembunyi (masked mRNA). Pengaturan umur mRNA juga dijumpai pada telur yang belum dibuahi. Sel telur ini akan mempertahankan diri untuk tidak mengalami pertumbuhan atau perkembangan. Dengan demikian, laju sintesis protein menjadi sangat rendah. Namun, hal ini bukan akibat kurangnya pasokan mRNA, melainkan karena terbatasnya ketersediaan suatu unsur yang dinamakan faktor rekrutmen. Hingga kini belum diketahui hakekat unsur tersebut, tetapi rupanya berperan dalam pembentukan kompleks ribosom-mRNA. Sintesis beberapa protein tertentu diatur oleh aktivitas protein itu sendiri terhadap mRNA. Sebagai contoh, konsentrasi suatu jenis molekul antibodi dipertahankan konstan oleh mekanisme inhibisi atau penghambatan diri dalam proses translasi. Jadi, molekul antibodi tersebut berikatan secara khusus dengan molekul mRNA yang menyandinya sehingga inisiasi translasi akan terhambat. Sintesis beberapa protein dari satu segmen DNA Pada prokariot terdapat mRNA polisistronik yang menyandi semua produk gen. Sebaliknya, pada eukariot tidak pernah dijumpai mRNA polisistronik, tetapi ada kondisi yang dapat disetarakan dengannya, yakni sintesis poliprotein. Poliprotein adalah polipeptida berukuran besar yang setelah berakhirnya translasi akan terpotong-potong untuk menghasilkan sejumlah molekul protein yang utuh. Tiap protein ini dapat dilihat sebagai produk satu gen tunggal. Dalam sistem semacam itu urutan penyandi pada masing-masing gen tidak saling dipisahkan oleh kodon stop dan kodon awal, tetapi dipisahkan oleh urutan asam amino tertentu yang dikenal sebagai tempat pemotongan (cleavage sites) oleh enzim protease tertentu. Tempat-tempat pemotongan ini tidak akan berfungsi serempak, tetapi bergantian mengikuti suatu urutan. 5. Manfaat Teknologi DNA dan Onkogen Secara klasik analisis molekuler protein dan materi lainnya dari kebanyakan organisme ternyata sangat tidak mudah untuk dilakukan karena adanya kesulitan untuk memurnikannya dalam jumlah besar. Namun, sejak tahun 1970-an berkembang suatu teknologi yang dapat diterapkan sebagai pendekatan dalam mengatasi masalah tersebut melalui isolasi dan manipulasi terhadap gen yang bertanggung jawab atas ekspresi protein tertentu atau pembentukan suatu produk. Teknologi yang dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan, atau dengan istilah yang lebih populer rekayasa genetika, ini melibatkan upaya perbanyakan gen tertentu di dalam suatu sel yang bukan sel alaminya sehingga sering pula dikatakan sebagai kloning gen. Banyak definisi telah diberikan untuk mendeskripsikan pengertian teknologi DNA rekombinan. Salah satu di antaranya, yang mungkin paling representatif, menyebutkan bahwa teknologi DNA rekombinan adalah pembentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga memungkinkannya untuk terintegrasi dan mengalami perbanyakan di dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai sel inang. Teknologi DNA rekombinan mempunyai dua segi manfaat. Pertama, dengan mengisolasi dan mempelajari masing-masing gen akan diperoleh pengetahuan tentang fungsi dan mekanisme kontrolnya. Kedua, teknologi ini memungkinkan diperolehnya produk gen tertentu dalam waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar daripada produksi secara konvensional. Pada dasarnya upaya untuk mendapatkan suatu produk yang diinginkan melalui teknologi DNA rekombinan melibatkan beberapa tahapan tertentu (Gambar 9.1). Tahapan-tahapan tersebut adalah isolasi DNA genomik/kromosom yang akan diklon, pemotongan molekul DNA menjadi sejumlah fragmen dengan berbagai ukuran, isolasi DNA vektor, penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor untuk menghasilkan molekul DNA rekombinan, transformasi sel inang menggunakan molekul DNA rekombinan, reisolasi molekul DNA rekombinan dari sel inang, dan analisis DNA rekombinan. Isolasi DNA Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah berikutnya adalah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Pada eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus. Setelah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang. Biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan CsCl (lihat Bab II). Teknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA genomik maupun DNA vektor, khususnya plasmid. Untuk memilih di antara kedua macam molekul DNA ini yang akan diisolasi dapat digunakan dua pendekatan. Pertama, plasmid pada umumnya berada dalam struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan mempunyai bentuk covalently closed circular (CCC), sedangkan DNA kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua untainya dan mempunyai nisbah aksial yang sangat tinggi. Perbedaan tersebut menyebabkan DNA plasmid jauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA kromosom. Oleh karena itu, aplikasi kondisi denaturasi akan dapat memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom. Pendekatan kedua didasarkan atas perbedaan daya serap etidium bromid, zat pewarna DNA yang menyisip atau melakukan interkalasi di sela-sela basa molekul DNA. DNA plasmid akan menyerap etidium bromid jauh lebih sedikit daripada jumlah yang diserap oleh DNA kromosom per satuan panjangnya. Dengan demikian, perlakuan menggunakan etidium bromid akan menjadikan kerapatan DNA kromosom lebih tinggi daripada kerapatan DNA plasmid sehingga keduanya dapat dipisahkan melalui sentrifugasi kerapatan. Enzim Restriksi Tahap kedua dalam kloning gen adalah pemotongan molekul DNA, baik genomik maupun plasmid. Perkembangan teknik pemotongan DNA berawal dari saat ditemukannya sistem restriksi dan modifikasi DNA pada bakteri E. coli, yang berkaitan dengan infeksi virus atau bakteriofag lambda (l). Virus l digunakan untuk menginfeksi dua strain E. coli, yakni strain K dan C. Jika l yang telah menginfeksi strain C diisolasi dari strain tersebut dan kemudian digunakan untuk mereinfeksi strain C, maka akan diperoleh l progeni (keturunan) yang lebih kurang sama banyaknya dengan jumlah yang diperoleh dari infeksi pertama. Dalam hal ini, dikatakan bahwa efficiency of plating (EOP) dari strain C ke strain C adalah 1. Namun, jika l yang diisolasi dari strain C digunakan untuk menginfeksi strain K, maka nilai EOP-nya hanya 10-4. Artinya, hanya ditemukan l progeni sebanyak 1/10.000 kali jumlah yang diinfeksikan. Sementara itu, l yang diisolasi dari strain K mempunyai nilai EOP sebesar 1, baik ketika direinfeksikan pada strain K maupun pada strain C. Hal ini terjadi karena adanya sistem restriksi/modifikasi (r/m) pada strain K. Pada waktu bakteriofag l yang diisolasi dari strain C diinfeksikan ke strain K, molekul DNAnya dirusak oleh enzim endonuklease restriksi yang terdapat di dalam strain K. Di sisi lain, untuk mencegah agar enzim ini tidak merusak DNAnya sendiri, strain K juga mempunyai sistem modifikasi yang akan menyebabkan metilasi beberapa basa pada sejumlah urutan tertentu yang merupakan tempat-tempat pengenalan (recognition sites) bagi enzim restriksi tersebut. DNA bakteriofag l yang mampu bertahan dari perusakan oleh enzim restriksi pada siklus infeksi pertama akan mengalami modifikasi dan memperoleh kekebalan terhadap enzim restrisksi tersebut. Namun, kekebalan ini tidak diwariskan dan harus dibuat pada setiap akhir putaran replikasi DNA. Dengan demikian, bakteriofag l yang diinfeksikan dari strain K ke strain C dan dikembalikan lagi ke strain K akan menjadi rentan terhadap enzim restriksi. Metilasi hanya terjadi pada salah satu di antara kedua untai molekul DNA. Berlangsungnya metilasi ini demikian cepatnya pada tiap akhir replikasi hingga molekul DNA baru hasil replikasi tidak akan sempat terpotong oleh enzim restriksi. Enzim restriksi dari strain K telah diisolasi dan banyak dipelajari. Selanjutnya, enzim ini dimasukkan ke dalam suatu kelompok enzim yang dinamakan enzim restriksi tipe I. Banyak enzim serupa yang ditemukan kemudian pada berbagai spesies bakteri lainnya. Pada tahun 1970 T.J. Kelly menemukan enzim pertama yang kemudian dimasukkan ke dalam kelompok enzim restriksi lainnya, yaitu enzim restriksi tipe II. Ia mengisolasi enzim tersebut dari bakteri Haemophilus influenzae strain Rd, dan sejak saat itu ditemukan lebih dari 475 enzim restriksi tipe II dari berbagai spesies dan strain bakteri. Semuanya sekarang telah menjadi salah satu komponen utama dalam tata kerja rekayasa genetika. Enzim restriksi tipe II antara lain mempunyai sifat-sifat umum yang penting sebagai berikut: 1. mengenali urutan tertentu sepanjang empat hingga tujuh pasang basa di dalam molekul DNA 2. memotong kedua untai molekul DNA di tempat tertentu pada atau di dekat tempat pengenalannya 3. menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan berbagai ukuran dan urutan basa. Sebagian besar enzim restriksi tipe II akan mengenali dan memotong urutan pengenal yang mempunyai sumbu simetri rotasi. Gambar 11.3 memperlihatkan beberapa enzim restriksi beserta tempat pengenalannya. Pemberian nama kepada enzim restriksi mengikuti aturan sebagai berikut. Huruf pertama adalah huruf pertama nama genus bakteri sumber isolasi enzim, sedangkan huruf kedua dan ketiga masing-masing adalah huruf pertama dan kedua nama petunjuk spesies bakteri sumber tersebut. Huruf-huruf tambahan, jika ada, berasal dari nama strain bakteri, dan angka romawi digunakan untuk membedakan enzim yang berbeda tetapi diisolasi dari spesies yang sama. Tempat pemotongan pada kedua untai DNA sering kali terpisah sejauh beberapa pasang basa. Pemotongan DNA dengan tempat pemotongan semacam ini akan menghasilkan fragmen-fragmen dengan ujung 5’ yang runcing karena masing-masing untai tunggalnya menjadi tidak sama panjang. Dua fragmen DNA dengan ujung yang runcing akan mudah disambungkan satu sama lain sehingga ujung runcing sering pula disebut sebagai ujung lengket (sticky end) atau ujung kohesif. Hal itu berbeda dengan enzim restriksi seperti Hae III, yang mempunyai tempat pemotongan DNA pada posisi yang sama. Kedua fragmen hasil pemotongannya akan mempunyai ujung 5’ yang tumpul karena masing-masing untai tunggalnya sama panjangnya. Fragmen-fragmen DNA dengan ujung tumpul (blunt end) akan sulit untuk disambungkan. Biasanya diperlukan perlakuan tambahan untuk menyatukan dua fragmen DNA dengan ujung tumpul, misalnya pemberian molekul linker, molekul adaptor, atau penambahan enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’. Ligasi Molekul – molekul DNA Pemotongan DNA genomik dan DNA vektor menggunakan enzim restriksi harus menghasilkan ujung-ujung potongan yang kompatibel. Artinya, fragmen-fragmen DNA genomik nantinya harus dapat disambungkan (diligasi) dengan DNA vektor yang sudah berbentuk linier. Ada tiga cara yang dapat digunakan untuk meligasi fragmen-fragmen DNA secara in vitro. Pertama, ligasi menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri. Kedua, ligasi menggunakan DNA ligase dari sel-sel E. coli yang telah diinfeksi dengan bakteriofag T4 atau lazim disebut sebagai enzim T4 ligase. Jika cara yang pertama hanya dapat digunakan untuk meligasi ujung-ujung lengket, cara yang kedua dapat digunakan baik pada ujung lengket maupun pada ujung tumpul. Sementara itu, cara yang ketiga telah disinggung di atas, yaitu pemberian enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’. Dengan untai tunggal semacam ini akan diperoleh ujung lengket buatan, yang selanjutnya dapat diligasi menggunakan DNA ligase. Suhu optimum bagi aktivitas DNA ligase sebenarnya 37ºC. Akan tetapi, pada suhu ini ikatan hidrogen yang secara alami terbentuk di antara ujung-ujung lengket akan menjadi tidak stabil dan kerusakan akibat panas akan terjadi pada tempat ikatan tersebut. Oleh karena itu, ligasi biasanya dilakukan pada suhu antara 4 dan 15ºC dengan waktu inkubasi (reaksi) yang diperpanjang (sering kali hingga semalam). Pada reaksi ligasi antara fragmen-fragmen DNA genomik dan DNA vektor, khususnya plasmid, dapat terjadi peristiwa religasi atau ligasi sendiri sehingga plasmid yang telah dilinierkan dengan enzim restriksi akan menjadi plasmid sirkuler kembali. Hal ini jelas akan menurunkan efisiensi ligasi. Untuk meningkatkan efisiensi ligasi dapat dilakukan beberapa cara, antara lain penggunaan DNA dengan konsentrasi tinggi (lebih dari 100µg/ml), perlakuan dengan enzim alkalin fosfatase untuk menghilangkan gugus fosfat dari ujung 5’ pada molekul DNA yang telah terpotong, serta pemberian molekul linker, molekul adaptor, atau penambahan enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’ seperti telah disebutkan di atas. Transformasi Sel Inang Tahap berikutnya setelah ligasi adalah analisis terhadap hasil pemotongan DNA genomik dan DNA vektor serta analisis hasil ligasi molekul-molekul DNA tersebut. menggunakan teknik elektroforesis (lihat Bab X). Jika hasil elektroforesis menunjukkan bahwa fragmen-fragmen DNA genomik telah terligasi dengan baik pada DNA vektor sehingga terbentuk molekul DNA rekombinan, campuran reaksi ligasi dimasukkan ke dalam sel inang agar dapat diperbanyak dengan cepat. Dengan sendirinya, di dalam campuran reaksi tersebut selain terdapat molekul DNA rekombinan, juga ada sejumlah fragmen DNA genomik dan DNA plasmid yang tidak terligasi satu sama lain. Tahap memasukkan campuran reaksi ligasi ke dalam sel inang ini dinamakan transformasi karena sel inang diharapkan akan mengalami perubahan sifat tertentu setelah dimasuki molekul DNA rekombinan. Teknik transformasi pertama kali dikembangkan pada tahun 1970 oleh M. Mandel dan A. Higa, yang melakukan transformasi bakteri E. coli. Sebelumnya, transformasi pada beberapa spesies bakteri lainnya yang mempunyai sistem transformasi alami seperti Bacillus subtilis telah dapat dilakukan. Kemampuan transformasi B. subtilis pada waktu itu telah dimanfaatkan untuk mengubah strain-strain auksotrof (tidak dapat tumbuh pada medium minimal) menjadi prototrof (dapat tumbuh pada medium minimal) dengan menggunakan preparasi DNA genomik utuh. Baru beberapa waktu kemudian transformasi dilakukan menggunakan perantara vektor, yang selanjutnya juga dikembangkan pada transformasi E.coli. Hal terpenting yang ditemukan oleh Mandel dan Higa adalah perlakuan kalsium klorid (CaCl2) yang memungkinkan sel-sel E. coli untuk mengambil DNA dari bakteriofag l. Pada tahun 1972 S.N. Cohen dan kawan-kawannya menemukan bahwa sel-sel yang diperlakukan dengan CaCl2 dapat juga mengambil DNA plasmid. Frekuensi transformasi tertinggi akan diperoleh jika sel bakteri dan DNA dicampur di dalam larutan CaCl2 pada suhu 0 hingga 5ºC. Perlakuan kejut panas antara 37 dan 45ºC selama lebih kurang satu menit yang diberikan setelah pencampuran DNA dengan larutan CaCl2 tersebut dapat meningkatkan frekuensi transformasi tetapi tidak terlalu esensial. Molekul DNA berukuran besar lebih rendah efisiensi transformasinya daripada molekul DNA kecil. Mekanisme transformasi belum sepenuhnya dapat dijelaskan. Namun, setidak-tidaknya transformasi melibatkan tahap-tahap berikut ini. Molekul CaCl2 akan menyebabkan sel-sel bakteri membengkak dan membentuk sferoplas yang kehilangan protein periplasmiknya sehingga dinding sel menjadi bocor. DNA yang ditambahkan ke dalam campuran ini akan membentuk kompleks resisten DNase dengan ion-ion Ca2+ yang terikat pada permukaan sel. Kompleks ini kemudian diambil oleh sel selama perlakuan kejut panas diberikan. Seleksi Transforman dan Seleksi Rekombinan Oleh karena DNA yang dimasukkan ke dalam sel inang bukan hanya DNA rekombinan, maka kita harus melakukan seleksi untuk memilih sel inang transforman yang membawa DNA rekombinan. Selanjutnya, di antara sel-sel transforman yang membawa DNA rekombinan masih harus dilakukan seleksi untuk mendapatkan sel yang DNA rekombinannya membawa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan. Cara seleksi sel transforman akan diuraikan lebih rinci pada penjelasan tentang plasmid (lihat Bab XI). Pada dasarnya ada tiga kemungkinan yang dapat terjadi setelah transformasi dilakukan, yaitu (1) sel inang tidak dimasuki DNA apa pun atau berarti transformasi gagal, (2) sel inang dimasuki vektor religasi atau berarti ligasi gagal, dan (3) sel inang dimasuki vektor rekombinan dengan/tanpa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan. Untuk membedakan antara kemungkinan pertama dan kedua dilihat perubahan sifat yang terjadi pada sel inang. Jika sel inang memperlihatkan dua sifat marker vektor, maka dapat dipastikan bahwa kemungkinan kedualah yang terjadi. Selanjutnya, untuk membedakan antara kemungkinan kedua dan ketiga dilihat pula perubahan sifat yang terjadi pada sel inang. Jika sel inang hanya memperlihatkan salah satu sifat di antara kedua marker vektor, maka dapat dipastikan bahwa kemungkinan ketigalah yang terjadi. Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe), yang pembuatannya dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase chain reaction (PCR). Penjelasan lebih rinci tentang teknik PCR dapat dilihat pada Bab XII. Pelacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan melalui cara yang dinamakan hibridisasi koloni (lihat Bab X). Koloni-koloni sel rekombinan ditransfer ke membran nilon, dilisis agar isi selnya keluar, dibersihkan protein dan remukan sel lainnya hingga tinggal tersisa DNAnya saja. Selanjutnya, dilakukan fiksasi DNA dan perendaman di dalam larutan pelacak. Posisi-posisi DNA yang terhibridisasi oleh fragmen pelacak dicocokkan dengan posisi koloni pada kultur awal (master plate). Dengan demikian, kita bisa menentukan koloni-koloni sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan. Onkogen Onkogen (oncogene) adalah gen yang termodifikasi sehingga meningkatkan keganasan sel tumor. Onkogen umumnya berperan pada tahap awal pembentukan tumor. Onkogen meningkatkan kemungkinan sel normal menjadi sel tumor, yang pada akhirnya dapat menyebabkan kanker. Riset terbaru menunjukkan bawa RNA pendek (small RNA) sepanjang 21-25 nukelotida yang dikenal sebagai RNA mikro (miRNA) dapat mengontrol onkogen. Onkogen pertama kali ditemukan tahun 1970, dan dinamakan SRC (baca: "sark"). SRC ditemukan sebagai onkogen pada retrovirus ayam. Riset yang dilakukan oleh Dr. G. Steve Martin dari Universitas California Berkeley menemukan bahwa SRC adalah benar onkogen virus. Tahun 1976 Dr. John Michael Bishop dan Dr. Harold E. Varmus dari Universitas California San Francisco membuktikan bahwa onkogen berasal dari proto-onkogen yang mengalami kerusakan. Proto-onkogen telah ditemukan pada banyak organisme, termasuk manusia. Atas penemuan penting ini, Dr. Bishop dan Dr. Varmus mendapat Penghargaan Nobel pada tahun 1989. Proto-onkogen Proto-onkogen adalah gen normal yang dapat menjadi onkogen bila mengalami mutasi, atau bila ekspresinya meningkat. Proto-onkogen mengkode protein yang diperlukan sel untuk regulasi perkembangbiakan dan diferensiasi. Proto-onkogen sering ditemukan berperan pada transduksi sinyal dan eksekusi sinyal mitogen, yang umumnya dilakukan oleh produk protein yang dihasilkannya. Setelah diaktifkan, proto-onkogen atau produk yang dihasilkan menjadi penginduksi tumor yang disebut onkogen. Aktivasi Proto-onkogen dapat menjadi onkogen dengan sedikit modifikasi pada fungsi aslinya. Ada dua tipe pengaktifan: • Terjadi mutasi pada satu onkogen yang berakibat perubahan pada struktur protein, yang disebabkan oleh: 1. kenaikan aktivitas protein (enzim) 2. hilangnya regulasi 3. terjadinya hibrid antar protein melalui kerusakan kromosom pada pembelahan sel. Telah diketahui bahwa kerusakan kromosom yang terjadi saat pembelahan sel pada sumum tulang belakang dapat menimbulkan leukemia. • Meningkatnya konsentrasi protein, yang disebabkan oleh: • meningkatkan ekspresi protein akibat kesalahan regulasi • meningkatnya stabilitas protein, yang membuat keberadaan dan aktivitasnya dalam sel menjadi lebih lama • duplikasi gen, yang berakinat meningkatnya jumlah protein dalam sel. Faktor pembelahan sel (Growth factors) Faktor pembelahan sel, atau mitogen, umumnya dihasilkan oleh beberapa sel spesialis untuk menginduksi pembelahan sel. Bila suatu cell yang umumnya tidak memproduksi growth factors tiba-tiba mulai memproduksinya (karena berubah menjadi onkogen), sel tersebut akan mengalami pembelahan tak terkontrol. Hal ini dapat juga menyebar ke sel-sel yang berdekatan. Daftar Pustaka http://biomol.wordpress.com/bahan-ajar/asam-nukleat/ http://inherent.brawijaya.ac.id/biomol/materi/ebook2.pdf http://wapedia.mobi/id/Replikasi http://biomol.wordpress.com/bahan-ajar/replikasi/ http://structbio.vanderbilt.edu/~eglim/images/hdnaComparison.jpg http://id.wikipedia.org/wiki/Translasi http://biomol.wordpress.com/bahan-ajar/pengat-eks-gen/ http://id.wikipedia.org/wiki/Onkogen http://biomol.wordpress.com/bahan-ajar/dasar-tek-dna-rek/